二、組織學研究方法

(一)一般光學顯微鏡術

應用一般光學顯微鏡(簡稱光鏡)觀察組織切片是組織學研究的最基本方法。取動物或人體的新鮮組織塊,先用固定劑(fixative)固定(fixation),使組織中的蛋白質迅速凝固,防止細胞自溶和組織腐敗。常用的固定劑如灑精、甲醛、醋酸、苦味酸、四氧化鋨等,一般常將幾種固定劑配制成混合固定液,以抵消或減弱單種固定劑對組織的收縮或膨脹等缺點,達到更好固定效果。固定后的組織塊(約3~5mm3大小)用石蠟、火棉膠或樹脂等包埋(embedding)成硬塊,以切片機(microtome)切成5~10μm厚的組織切片(tissue section),切片貼在載玻片上經脫蠟等步驟后進行染色。組織塊也可立即投入液氮(-196℃)內快速凍結,用恒冷箱切片機(cryostat)制成冷凍切片(frozen section),這種方法制片迅速,細胞內酶活性保存較好,常用于酶組織化學染色。血細胞和分離培養的細胞可直接涂在玻片上,制成涂片(smear)。疏松結締組織和腸系膜等軟組織可撕成薄片鋪在玻片上(鋪片),牙和骨等堅硬組織可磨成薄片(磨片)。組織切片等標本經染色、透明后,以封固劑和蓋片封固,即可長期保存,鏡下觀察。

 堅牢綠(酸性染料)與亞甲藍(堿性染料)的化學結構及其染色反應示意

圖1-1 堅牢綠(酸性染料)與亞甲藍(堿性染料)的化學結構及其染色反應示意

染色(staining)是用染料使組織切片著色,便于鏡下觀察。天然和人工合成的染料甚多,它們都是含發色團的有機化合物,當染料具有助色團成為鹽類物質,即可溶解于水并具電荷,與組織有親合力,使組織著色。含氨基(-NH2)、二甲氨基〔-N(CH32〕等堿性助色團的染料,稱堿性染料(basic dye),它的鹽溶液具陽電荷;含羧基(-COOH)、羥基(-OH)或磺基(-SO3H)等酸性助色團的染料,稱酸性染料(acid dye),它的溶液具陰電荷(圖1-1)。組織的染色原理一般認為基于化學結合或物理吸附作用。細胞和組織的酸性物質或結構與堿性染料親合力強者,稱嗜堿性(basophilia);而堿性物質或結構與酸性染料親合力強者,稱嗜酸性(acidophilia);若與兩種染料的親合力均不強者,稱中性(neutrophilia)。組織的基本成分是蛋白質,構成蛋白質的氨基酸常是即有含氨基的,也有含羧基的,是兩性電解質。各種蛋白質的等電點因氨基酸成分的不同而異,其電荷性質又與溶液的pH值相關,根據研究目的選用合適的染色方法,調整好染液的pH值,即可取得良好染色效果。常用的酸性染料如伊紅、堅牢綠、橙黃G等,堿性染料如蘇木精、亞甲藍、堿性品紅等。組織學中最常用的是蘇木精(hematoxylin)和伊紅(eosin)染色法,簡稱HE染色法。蘇木精使細胞核和胞質內的嗜堿性物質著藍紫色,伊紅使細胞質基質和間質內的膠原纖維等著紅色。

物理吸附作用的染色方法,如用蘇丹染料顯示脂肪組織,染料溶于脂肪內,使細胞內的脂滴顯色。又如用硝酸銀、氯化金等重金屬鹽顯示細胞和組織的某些結構,則是使金屬微粒附著在結構表面而呈棕黑色或棕黃色。銀染法中有些組織結構可直接使硝酸銀還原而顯示,稱此為親銀性(argentaffin);有些結構無直接還原作用,需加入還原劑方能顯色,則稱為嗜銀性(argyrophilia)。還有些組織成分如結締組織和軟骨基質中的糖氨多糖,當用甲苯胺藍(toluidine blue)等堿性染料染色后呈紫紅色,這種現象稱為異染性(metachromasia),其原理可能是該染料在溶液中呈單體狀態時顯藍色,當它與多陰離子的高分子物質耦合后,染料分子聚合成多聚體而顯紅色(圖1-2)。還有些染色方法的原理至今還不清楚。

異染性示意圖

圖1-2 異染性示意圖

(二)幾種特殊顯微鏡的應用

1.熒光顯微鏡 熒光顯微鏡(fluorescence microscope)是用來觀察標本中的自發熒光物質或以熒光素染色或標記的細胞和結構。熒光顯微鏡是以高壓汞燈產生的短波紫外線為光源,并配有激發、阻斷、吸熱和吸收紫外線等濾片系統,標本中的熒光物質在紫外線激發下產生各種顏色的熒光,借以研究該熒光物質在細胞和組織內的分布。組織中的自發性熒光物質如神經細胞和心肌細胞等內的脂褐素呈棕黃色熒光,肝貯脂細胞和視網膜色素上皮細胞內的維生素A呈綠色熒光,某些神經內分泌細胞和神經纖維內的單胺類物質(兒茶酚胺、5-羥色胺、組胺等)在甲醛作用下呈不同顏色的熒光,組織內含有的奎寧、四環素等藥物也呈現一定的熒光。細胞內的某些成分可與熒光素結合而顯熒光,如溴化乙錠與吖啶橙可與DNA綜合,進行細胞內DNA含量測定。熒光顯微鏡更廣泛用于免疫細胞化學研究,即以異硫氰酸或羅丹明等熒光素標記抗體(一抗或二抗),用該標記抗體直接或間接地與細胞內的相應抗原結合,以檢測該抗原的存在與分布。

2.相差顯微鏡 相差顯微鏡(phase contrast microscope)是用于觀察組織培養中活細胞形態結構的。活細胞無色透明,一般光鏡下不易分辨細胞輪廓及其結構。相差顯微鏡的特點是將活細胞不同厚度及細胞內各種結構對光產生的不同折射作用,轉換為光密度差異(明暗差),使鏡下結構反差明顯,影像清楚。組織培養研究常用的是倒置相差顯微鏡(inverted phase contrast microscope),它的光源和聚光器在載物臺的上方,物鏡在載物臺的下方,便于觀察貼附在培養器皿底壁上的活細胞。

3.暗視野顯微鏡 暗視野顯微鏡(dark-field microscope)主要用于觀察因反差或分辨力不足的微小顆粒。此種顯微鏡主要是有一個暗視野集光器,使光線不直接進入物境,故呈暗視野。而標本內的小顆粒產生的衍射光或散射光進入物鏡,暗視野中的顆粒呈明亮小點,如同在暗室可見一束光線中的微小塵粒一般。普通通光鏡最大分辨率為0.2μm,暗視野顯微鏡則可分辨0.004~0.2μm的微粒,適用于觀察細胞內線粒體運動及標本中細菌等微粒的運動等。

4.共集激光掃描顯微鏡 共焦激光掃描顯微鏡(confocal laser scanning microscope,CLSM)是近10年研制成的高光敏度、高分辨率的新型儀器。它以激光為光源,光束經聚焦后落在樣品(組織厚片或細胞)不同深度的微小一點,并作移動掃描,通過電信號彩色顯像,經過微機圖像分析系統進行二維和三維分析處理。CLSM可對細胞進行三維結構圖像分析,細胞內各種熒光標記物的微量分析,細胞內Ca2+、pH值等的動態分析測定,細胞的受體移動、膜電位變化、酶活性和物質轉運的測定,并以激光對細胞及其染色體進行切割、分離、篩選和克隆。因此,CLSM是一種高技術產品,可對細胞的多種功能進行全自動、高效、快速的微量定性和定量測定。

其他如偏光顯微鏡用于研究組織晶體物質及纖維等的光學性質,紫外光顯微鏡用于研究細胞內核酸的分布與定量等。

(三)組織化學和細胞化學術

組織化學(histochemistry)和細胞化學(cytochemistry)技術是通過化學或物理反應原理顯示組織切片細胞內某種化學成分,進行定位、定量及其與功能相關的研究。如糖類、脂類、酶、核酸等與試劑發生化學物理反應,形成有色終末產物,在光鏡下觀察,有的可在電鏡下觀察。

1.糖類顯示多糖和蛋白多糖的常用方法是過碘酸-雪夫反應(periodic acid Schiff reaction,PAS反應)。基本原理是過碘酸的氧化作用先使糖分子的乙二醇基變為乙二醛基,后者繼而與Schiff試劑(無色亞硫酸品紅復合物)結合,形成紫紅色反應產物(圖1-3)。顏色反應的深淺取決于組織內多糖的乙二醇分子的多寡。

PAS反應原理示意圖

圖1-3 PAS反應原理示意圖

2.脂類脂類物質包括脂肪和類脂。標本用甲醛固定,冷凍切片,脂類保存較好。多用蘇丹染料、油紅O、尼羅藍等溶于脂類的染料染色,使脂質呈色。也可用四氧化鋨(OSO4)染色,脂肪酸或膽堿可使OSO4還原為OSO2而呈黑色。

3.酶細胞內的酶種類甚多,有氧化還原酶、水解酶、合成酶、轉移酶等幾類,目前已有100多種酶組織化學染色法。酶組化反應的基本原理是利用酶對其相應底物的水解、氧化等作用,然后再使底物的反應產物與某種捕獲劑發生反應,形成沉淀或有色的最終產物,借此檢測該酶在組織切片或細胞內的分布及活性強弱。如細胞的磷酸酶是一種重要的水解酶,堿性磷酸酶(ALP)和酸性磷酸酶(ACP)在合適的pH條件下可水解有機磷酸脂。小腸上皮細胞表面的紋狀緣和腎近曲小管表面的刷狀緣處,微絨毛含有豐富的ALP,與物質的吸收和轉運功能相關;許多細胞的溶酶體內則含大量ACP,參與細胞內物質代謝。這兩種酶均可以β-甘油磷酸鈉為底物,底物被水解產生磷酸根,再以Ca2+、Co2+(顯示ALP)或Pb2+(顯示ACP)捕獲磷酸根,最后用硫化銨處理,即形成硫化鈷或硫化鉛黑色最終產物,出現在組織切片中該酶存在的部位。因此,酶組化染色不是酶本身的直接顯色,而是酶作用底物的化學反應產物顯色的。

4.核酸 顯示DNA的傳統方法是Feulgen反應,切片先用稀鹽酸處理,使DNA分子中脫氧核糖與嘌呤之間的連接鍵打開,形成醛基,再與Schiff 試劑作用,原理同PAS反應,使細胞核DNA顯紫紅色。還可用甲基綠-焦寧染色法同時顯示DNA和RNA,這兩種染料都是堿性,甲基綠使細胞核內的DNA呈藍綠色,焦寧使細胞質和核仁內的RNA呈紅色。

 免疫細胞化學術示意圖

圖1-4 免疫細胞化學術示意圖

人呼吸道分離上皮細胞粘蛋白免疫熒光像

圖1-5 人呼吸道分離上皮細胞粘蛋白免疫熒光像

(美國戴維斯加州大學 吳忍教授供圖)

(四)免疫細胞化學術

免疫細胞化學(immunocytochemistry)術是應用抗原與抗體結合的免疫學原理,檢測細胞內多肽、蛋白質及膜表面抗原和受體等大分子物質的存在與分布。這種方法特異性強,敏感度高,進展迅速,應用廣泛,成為生物學和醫學眾多學科的重要研究手段。近年隨著純化抗原和制備單克隆抗體的廣泛開展以及標記技術不斷提高,免疫細胞化學的進展更是日新月異,不僅用于許多基本理論的研究,并取得重大突破,而且也用于疾病的早期快速診斷等臨床實際。組織的多肽和蛋白質種類繁多,具有抗原性。分離純化人或動物組織某種蛋白質,作為抗原注入另一種動物體內,后者即產生相應的特異性抗體(免疫球蛋白)。從被免疫動物的血清中提取出該抗體,再以熒光素、酶、鐵蛋白或膠體金標記,用這種標記抗體處理組織切片或細胞,標記抗體即與細胞的相應蛋白質(抗原)發生特異性結合(圖1-4)。常用的熒光素是異硫氰酸熒光素(FITC)和四甲基異硫氰酸羅丹明(TRITC),在熒光顯微鏡下可觀察熒光抗體抗原復合物(圖1-5)。常用的酶是辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP,從辣根菜中提取的),它的底物是3,3'-二氨基、聯苯胺(DAB)和H2O2,HRP使DAB氧化形成棕黃色產物,可在光鏡和電鏡下觀察(圖1-6)。鐵蛋白和膠體金標記抗體與抗原的結合,也可在光鏡和電鏡下觀察(圖1-7)。

大鼠腺垂體免疫組織化學(PAS法)示生長激素細胞

圖1-6 大鼠腺垂體免疫組織化學(PAS法)示生長激素細胞

(上海醫科大趙培林教授供圖)

免疫細胞化學(蛋白A-膠體金法)和原位雜交術示大鼠垂體

圖1-7 免疫細胞化學(蛋白A-膠體金法)和原位雜交術示大鼠垂體

催乳素細胞電鏡像 N催乳素細胞核

↑分泌顆粒內顯示金粒

粗面內質網(RER)顯示銀粒

粗面內質網(RER)顯示銀粒

(加拿大Douglas醫院研究中心童毅愛博士贈圖)

標記抗體民被檢抗原的結合方式有兩種。一是直接法,即如上述用標記抗體與樣品中的抗原直接結合(圖1-8)。這種方法操作簡便,但敏感度不及間接法。間接法是將分離的抗體(第一抗體簡稱一抗)再作為抗原免疫另一種動物,制備該抗體(抗原)的抗體(第二抗體簡稱二抗),再以標記物標記二抗。先后以一抗和標記二抗處理樣品,最終形成抗原一抗-標記二抗復合物(圖1-8)。間接法中的一個抗原分子可通過一抗與多個標記二抗相結合,因此它的敏感度較高,而且目前國內外均有多種標記二抗商品供應,使用方便。間接法中較常用的是一種稱之為過氧化物酶-抗過氧化物酶復合物法(peroxidase-antiperoxidase complexmethod,PAS法),該法除需一抗和二抗外,還需制備HRP標記的抗酶抗體,即以HRP作為抗原免疫動物,制成抗HRP抗體,再以HRP標記該抗體制成由3個酶分子與2個抗酶抗體組成的相當穩定的環形PAP復合物。標本先后以一抗、二抗和PAP復合物處理后,再以DAB顯色,即可檢測抗原的分布。此法由于細胞內的抗原通過抗體的層層放大而與多個酶分子結合,因此敏感性很強(圖1-9)。

 免疫細胞化學直接法(A)與間接法(B)示意圖

圖1-8 免疫細胞化學直接法(A)與間接法(B)示意圖

 免疫細胞化學PAP法示意圖

圖1-9 免疫細胞化學PAP法示意圖

免疫細胞化學術近10年來又有新進展,如生物素-親合素等新穎試劑的應用,為檢測微量抗原、受體、抗體開辟了新途徑。生物素(biotin)又稱維生素H,是從卵黃和肝中提取的一種小分子物質(分子量244.31);親合素(avidin)又稱卵白素,是從卵白中提取的一種糖蛋白(分子量68kD)。每個親合素分子有生物素結合的4個位點,二者可牢固結合成不可逆的復合物。生物素-親合素的應用大致有三種方法。①標記親合素-生物素法(labelled avidin- biotin method,LAB法):將親合素與標記物(HRP)結合,一個親合素可結合多個HRP;將生物素與抗體(一抗與二抗)結合,一個抗體分子可連接多個生物素分子,抗體的活性不受影響。細胞的抗原(或通過一抗)先與生物素化的抗體結合,繼而將標記親合素結合在抗體的生物素上,如此多層放大提高了檢測抗原的敏感性(圖1-10)。②橋連親合素-生物素法(bridged avidin-biotin method,BAB法):先使抗原與生物素化的抗體結合,再以游離親合素將生物素化的抗體與酶標生物素搭橋連接,也達到多層放大效果(圖1-10)。③親合素-生物素-過氧化物酶復合物法(avidin-biotin-peroxidase complexmethod,ABC法);此法是前兩種方法的改進,即先按一定比例將親合素與酶標生物素結合在一起,形成親合素-生物素-過氧化物酶復合物(ABC復合物),標本中的抗原先后與一抗、生物素化二抗、ABC復合物結合,最終形成晶格樣結構的復合體,其中網絡了大量酶分子,從而大大提高了檢測抗原的靈敏度(圖1-10)。現有配制現成的ABC藥盒商品供應,操作簡便,是目前廣泛應用的一種方法。

生物素-親合素免疫細胞化學示意圖

圖1-10 生物素-親合素免疫細胞化學示意圖

(1)標記親合素-生物素法

(2)橋連親合素-生物素法

(3)親合素-生物素-過氧化物酶復合物法(ABC法)

(五)同位素示蹤術

同位素示蹤術是用放射性核素的射線作用,研究細胞對某種物質的吸收、合成、轉運和分泌等代謝過程。將放射性核素或其標記物注入動物體內或加入細胞培養的培養基內,細胞攝取該物質后,取被檢組織制成切片或細胞涂片。可用顯微鏡放射自顯影術(microau toradiography)檢測該放射性物質在細胞內的原位分布及其代謝轉歸,即將薄層感光乳膠涂在切片或涂片的表面,標本在暗盒內保存一定時間后,細胞內的放射性核素產生的射線使乳膠中的溴化銀還原為銀粒,經顯影和定影后在光鏡下觀察銀粒的分布。β射線能量低,射程短,電離作用強,常用的β射線核素是3H、14C、32P、35S、45Ca、131I。如用3H-胸腺嘧啶核苷研究細胞DNA合成及細胞增殖動態(圖1-11)。用35S-蛋氨酸研究某些腺細胞分泌物的合成與排泄,用131I-碘化鈉研究甲狀腺素的合成等。還可做標本中的銀粒數計量或其光密度測定,進行定量分析。另外,也可用液體閃爍計數器測定分離細胞或其勻漿的放射線強度,進行定量研究。

(六)原位雜交術

原位雜交術(in situ hybridization)是一種核酸分子雜交技術,它是通過檢測細胞內mRNA和DNA序列片段,原位研究細胞合成某種多肽或蛋白質的基

大鼠肝大部切除后再生過程中增殖期肝細胞

圖1-11 大鼠肝大部切除后再生過程中增殖期肝細胞

攝取3H標記的胸腺嘧啶核苷放射自顯影像

↑ 增殖期肝細胞核

因表達。其基本原理是根據兩條單鏈核苷酸互補堿基序列專一配對的特點,應用已知堿基序列并具有標記物的RNA或DNA片段即核酸探針(probe),與組織切片或細胞內的待測核酸(RNA或DNA片段)進行雜交,通過標記物的顯示,在光鏡或電鏡下觀察目的mRNA或DNA的存在與定位。此項技術需首先制備某種核酸探針,其種類主要有三種:①利用大肝桿菌重組帶有目的基因的質粒DNA,制成互補DNA探針(cDNA);②應用限制性核酸內切酶消化制成線性DNA模板,在體外轉錄獲得反意RNA探針(cDNA);③依照待測核酸的核苷酸序列,應用DNA合成儀合成寡聚核苷酸探針。cRNA和cDNA的常用標記物有32S、32P、3H等放射性核素和熒光素、生物素、地高辛等非放射性物質。組織學應用的原位雜交術主要是染色體原位雜交和細胞原位雜交。前者是研究遺傳基因、抗原基因、受體基因、癌基因等在染色體上的定位與表達;后者是研究細胞某種蛋白質的基因轉錄物mRNA在胞質內的定位與表達(圖1-7,1-12)。核酸分子雜交術有很高的敏感性和特異性,它是免疫細胞化學的基礎上,進一步從分子水平探討細胞功能的表達及其調節機制的,已成為當前細胞生物學、分子生物學研究的重要手段。

原位雜交術光鏡像

圖1-12 原位雜交術光鏡像

A 32P標記胰島素cRNA探針放射自顯影顯示大鼠胰島B細胞內胰島素mRNa

B 地高辛-堿性磷酸酶標記胰島素cRNA探針顯示大鼠胰島B細胞內胰島素mRNA

C 地高辛-堿性磷酸酶標記心鈉素cRNA探針顯色示體外培養的人胎兒臍靜脈

內皮細胞內的心鈉素mRNA ×850

(第三軍醫大學蔡文教授供圖)

(七)細胞和細胞化學定量術

組織和細胞形態結構及其化學成分的定量研究,是以量的測定及其數據變化闡述組織和細胞的生長、分化、代謝和功能的演變以及對環境因素和致病因素的反應。生命科學的研究不斷深入,定量技術的應用日益廣泛并有所進展。

1、顯微鏡分光亮度定量術此方法是應用顯微分光亮度計(microspectrophotometer)測定組織化學和免疫組織化學染色標本的反應強弱,進行化成分的定量分析的。基本原理是細胞內某種物質的含量不同,其染色反應的深淺不一,對一定波長的光吸收也就不同,即某物質的消亮度與一定厚度和面積內的該物質濃度成正比。通過光電組合自動控制系統將消光度轉換為電信號,即可得出光密度值(O、D值),進行定量分析比較。前述熒光素染色、酶和核酸組織化學染色、多肽和蛋白質免疫組化染色、放射自顯影和原位雜交等標本,均可應用顯微分光光度計做定量分析。

2、形態計量術 形態計量術(morphometry)是運用數學和統計學原理對組織和細胞進行二維和三維的形態測量研究,如細胞及其微細結構成分的數量、體積、表面積、周長等的相對和絕對值的測量,其中三維立體結構的研究又稱體視學(stereology)。機體組織的光鏡結構計量已有不少有意義的資料,如人和動物的肺泡數量和表面積,腎小體的數量和體積比,肝細胞的體積和數量,胰島的數量及各類細胞的數量比,腺垂體各種內分泌細胞的數量比等。通過組織切片或照片(光鏡和電鏡)平面圖像的測量,推算其立體結構數值,傳統方法是將測試系統(點、線、方格等)投影或覆蓋在切片上或照片上,把若干樣品的平面測量數據按數學公式推算出其立體數值。目前已廣泛應用圖像分析儀(image analyzer)進行形態計量研究,該儀器也是光學、電子學和計算機高技術產品,它是將切片或照片圖像通過攝像機顯示于監示器屏幕上,并根據不同結構的顏色深淺(灰度)及各像點的大小位置,快速準確地得出所需的各種形態數據。組織化學和免疫組織化學染色標本,也可應用圖像分析儀測定其光密度值,進行定量分析。

3、流式細胞術 流式細胞術(flow cytometry,FCM)是近年建立的細胞分類和定量研究技術,它是應用流式細胞儀(或稱熒光激活細胞分類器,fluroescent activated cell sorter)對單個細胞生物化學和生物物理特性進行快速定量測定的。工作原理是先分離被檢細胞制成懸液,并作熒光染色或標記,使單細胞液流快速通過該儀器的激光器照射分析區,被檢細胞產生的不同熒光信號轉變為電脈沖,分別輸入計算機內貯存,并顯示于示波器屏幕上,即可獲得該細胞群體中不同類型細胞的有關數據,如不同細胞的數量、熒光強度以及細胞體積、表面積和內部結構等參數;還可使細胞附有不同電荷,分類收集各種細胞,該技術的特點是速度快,精確性高,靈敏度大,已成為一種重要手段廣泛用于細胞動力學、遺傳學、免疫學、腫瘤學等的研究。如細胞DNA,RNA或某種蛋白質的含量分析,單個染色體DNA含量及分選,淋巴細胞膜抗原或受體的分析及細胞亞群分選,雜交細胞等的分選等,也用于腫瘤臨床診斷及療效和預后的分析等。

(八)電子顯微鏡術

1、透射電鏡術 透射電鏡(transmission electron microscope,TEM)是以電子束穿透樣品(組織的超薄切片),經聚合放大后,顯像于熒光屏上進行觀察和攝片的。電鏡的放大倍數的分辨率比光鏡大得多,放大倍數為幾萬至幾十萬倍,分辨率可達0.2nm。標本制備較光鏡的更嚴格,新鮮組織切成小塊(lmm3),用戊二醛,多聚甲醛、四氧化鋨等固定,樹脂包埋,以超薄切片機切成厚50~80nm的超薄切片,經醋酸鈾和檸檬酸鉛等重金屬電子染色后,置于電鏡下觀察,標本在熒光屏上呈黑白反差的結構影像。被重金屬浸染呈黑色的結構,稱電子密度高(electron-dense);反之,淺染的部分稱電子密度低(electron-lucent),這種染色稱正染色(positive staining)。若被染結構著色淺淡,而其周圍部分染成黑,是稱為負染色(negative stainning)。透射電鏡的電子槍加速電壓50~100kV,電子束穿透力低,近年制成加速電壓500kV以上的超高壓電鏡,電子束穿透力很強,可觀察0.5~10μm厚的切片,可觀察細胞內骨架等的立體超微結構。應用電鏡觀察細胞化學染色標本,稱電鏡細胞化學術(electron microscope cytochemistry);電鏡觀察免疫細胞化學染色標本,稱免疫電鏡術(immunoelectron microscopy);電鏡與放射自顯影結合的方法稱電鏡放射自顯影術(electron microscopeautoradiography)。

2、掃描電鏡術 掃描電鏡(scanning electron microscope,SEM)是用于觀察組織表面的立體結構的。組織塊經固定后,置于真空鍍膜儀內于燥,在標本表面先后噴鍍一層碳膜和合金膜,即可置于鏡下觀察。掃描電鏡的景深長,樣品表面的金屬膜可提高其導電性和圖像反差,在熒光屏上掃描成像,呈現富有立體感的表面圖像,如細胞表面的突起、微絨毛、纖毛及細胞的分泌與吞噬行為等(圖1-13)。

 大鼠分離肝巨噬細胞粘著吞噬羊紅細胞掃描電鏡像

圖1-13大鼠分離肝巨噬細胞粘著吞噬羊紅細胞掃描電鏡像

M肝巨噬細胞,R羊紅細胞

 冷凍蝕刻標本制備示意圖

圖1-14 冷凍蝕刻標本制備示意圖

 細胞單位膜從中間層劈開示意圖

圖1-15 細胞單位膜從中間層劈開示意圖

3、冷凍蝕刻復型術和冷凍割斷術

冷凍蝕刻復型術(tfeeze etch replica):是在透射電鏡下觀察組織或細胞斷裂面的金屬復制膜,顯示細胞微細結構的立體影像。組織塊先經甘油生理鹽水處理(防止形成冰晶)后投入液氮快速冷凍,在低溫下用鋼刀將樣品劈開,形成凹凸不平的斷裂面:-100℃真空下使斷裂面的冰晶升華,暴露不平整表面;在斷裂面上先后噴鍍一層合金膜和碳膜,用次氯酸等組織腐蝕掉;將反差的凸凹不平的金屬復型膜置于鏡下觀察(圖1-14)。此項技術尤適用研究生物膜的內部結構,如從單位膜的脂質分子疏水端劈開(圖1-15),經蝕刻鍍膜,鏡下可見質膜斷裂面復型膜結構狀態(圖1-16),其凹凸影像恰與實物相反。

小鼠腎近曲小管微絨毛冷凍蝕刻復型電鏡像

圖1-16小鼠腎近曲小管微絨毛冷凍蝕刻復型電鏡像 ×38300

MV微絨毛 E E面,P P面(白求恩醫科大學尹昕、朱秀雄教授供圖)

冷凍割斷術(freeze cracking):是將固定組織包埋在樹脂內,低溫下割斷,斷面噴鍍合金,在掃描電鏡下觀察斷面的立體構型。該技術適于研究組織內部微細結構的相互關系,如肝細胞與肝血竇和膽小管的關系,腎小體的腎小囊與血管球的關系等(圖1-17)。

大鼠腎冷凍割斷掃描電鏡示腎小體

圖1-17 大鼠腎冷凍割斷掃描電鏡示腎小體

R腎小囊外表面,G血管球,T腎小管

(白求恩醫科大學尹昕、朱秀雄教授供圖)

4、電鏡X-射線顯微分析術X-射線顯微分析術(X-ray microanalysis)是研究細胞和組織內元素的種類、分布和含量的新技術。它是利用高速電子束轟擊電鏡內生物標本的微小區域,使該區所含的元素發射了一定波長的X-射線,通過檢測器對X-射線進行波譜或能譜分析,即可測定微區內元素的性質、含量和分布。如測定細胞內Na、K、Ca、Fe、P、Cl等及某些微量元素的含量和分布變化,探討各種元素與細胞生理和病理的關系。

(九)組織培養術

前述幾種方法都是取人體或在體(in vivo)實驗動物的組織,經固定等處理后,對已死亡的組織進行觀察研究的。組織培養(tissue culture)或稱體外實驗(in vitro)則是取活組織或活細胞在體外適宜的環境中培養成活,進行實驗研究。細胞在體外生存必須具有近似體內的生存條件,如充足營養供應,合理的O2與CO2比例,必要的電解質和適宜的滲透壓,pH值、溫度和濕度等,還需防止微生物污染。組織培養的特點在于可用研究各種理化因子(溫度、激素、藥物、毒物等)對活細胞的直接影響,并能觀察記錄(攝影、錄像)。組織培養與前述方法結合應用,可研究某種因素對細胞增殖、分化、代謝、運動、吞噬、分泌等影響和調節的動態過程,以及細胞病變、癌變和逆轉等機理,獲得在體實驗難達到的研究目的。

組織培養用液為平衡鹽水及血清(小牛血清、胎盤血清等),羊水、腹水、組織浸出液等天然培養基(natural medium)。天然培養基成分復雜,且不穩定。目前廣泛應用人工合成培養基(synthetic medium)現有多種商品供應,使用方便,但常仍需補充部分血清等。若僅用合成培養基和已制備好的幾種必須因子與激素,稱此為無血清培養基(serum-free medium),其成分和含量均是已知的,可精細研究某種因子對細胞的生物效應。

組織培養的方法甚多,常用容器有凹玻片、培養皿、培養瓶、培養板、流動小室等。取組織塊貼于瓶底進行培養,可觀察從組織塊生長遷移出的細胞。取胚胎某器官原基或器官的一部分進行培養,稱器官培養(organ culture)。更精細的方法是分離和純化組織中的某種細胞,使之貼附在瓶底形成單層細胞(圖1-18),稱此為細胞培養(cell culture)。首次培養的細胞,稱原代培養(primary cultrue;細胞增殖而密集再傳代培養,稱傳代培養(subculture)。經長期培養而成的細胞群體,稱細胞系(cell line);用細胞克隆(cell clone)或單細胞培養而建成的某種純細胞群體,稱細胞株(cell strain)。它們均可在液氮內長期凍存,供隨時應用。現已建成多種腫瘤細胞株,廣泛用于實驗研究。

體外培養的上皮細胞在相差顯微鏡下的圖像

圖1-18 體外培養的上皮細胞在相差顯微鏡下的圖像(北京腫瘤研究所鄂征教授供圖)

(十)細胞融合術

2個或2個以上的細胞融合成為一個細胞,稱為細胞融合(cell fusion)。正常人體內也有細胞融合現象,如兩性生殖細胞結合而成受精卵,多個巨噬細胞融合成一個體積很大的多核異物巨細胞。體外用人工方法使兩種細胞融合,制成一種新品系的雜交細胞(hybrid cell),篩選出的此種雜交細胞有很強的生命力,增殖也很旺盛。常用的細胞融合誘導物是仙臺病毒(Sendai virus)和聚乙烯二醇(polythyleneglycol,PEG)。細胞融合術是細胞遺傳術、細胞免疫學、病毒學、腫瘤學等研究的一種重要手段,如將受抗原刺激后的小鼠脾淋巴細胞分離出來,與已建立的小鼠骨髓瘤(漿細胞瘤)細胞融合,篩選出的雜交瘤細胞可長期存活和增殖,成為制備單克隆抗體的細胞株。

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